鱼肉中孔雀石绿残留物的快速检测表面增强拉曼光谱法

 

 

 

1、范围

 

    本文件规定了采用表面增强拉曼光谱法快速测定鱼肉中孔雀石绿残留量的方法。

 

    本文件适用于鱼肉中孔雀石绿的表面增强拉曼光谱快速筛查检测。

 

 

2、规范性引用文件

 

    下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

 

    GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

 

    GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法

 

 

3、术语和定义

 

3.1  表面增强剂surfaceenhancer

 

    能够显著增强吸附在其表面的分子的拉曼散射信号的纳米结构材料。

 

3.2  空白样品blanksamples

 

    不含目标分析物，且组成及物理化学性质与检测样品相同或充分相似的样品。[来源：GB/T32467-2015，有修改]

 

 

4、方法原理

 

    试样中的孔雀石绿残留用乙腈提取，经中性氧化铝柱净化后，用表面增强拉曼检测仪测定。孔雀石绿分子与表面增强剂混合后，目标分子吸附在表面增强纳米粒子上从而增强其拉曼散射信号。表面增强拉曼检测仪可通过自动识别特征峰对孔雀石绿进行定性检测。

 

 

5、试剂与材料

 

    本方法所用水为GB/T6682规定的三级水。

 

5.1  试剂

 

5.1.1  乙腈（CH3CN）：分析纯。

 

5.1.2  醋酸铵（CH3COONH4）：分析纯。

 

5.1.3  无机盐混凝剂：1mol/L氯化钠水溶液，或其他相当的无机盐溶液。

 

5.1.4  醋酸铵溶液（5mmol/L）：称取0.385g醋酸铵，用水溶解，定容至1000mL，现用现配。

 

5.2  标准品

 

5.2.1  孔雀石绿标准品（CAS569-64-2）：纯度≥99.0%。

 

 

5.3  标准溶液配制

 

5.3.1  孔雀石绿标准储备溶液（50μg/mL）

 

    称取5.0mg（精确至0.01mg）孔雀石绿标准品于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，-18°C避光保存，有效期3个月。

 

5.3.2  孔雀石绿标准中间溶液（0.5μg/mL）

 

    吸取1.00mL孔雀石绿标准储备溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，-18°C避光保存，有效期1个月。

 

5.3.3  孔雀石绿标准工作溶液（5μg/L）

 

    吸取1.00mL孔雀石绿标准中间溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，现用现配。

 

5.4  材料

 

5.4.1  表面增强剂：纳米金-三聚氰胺海绵[1]，纳米金，纳米银，或其他适用。

 

5.4.2  中性氧化铝柱：80~120目，使用前用5mL乙腈活化。

 

5.4.3  有机0.2μm滤膜。

 

 

6、仪器和设备

 

6.1  表面增强拉曼光谱仪。

 

6.2  分析天平：感量0.01mg、0.01g。

 

6.3  离心机：转速⩾4000r/min。

 

6.4  涡旋仪。

 

6.5  匀浆机。

 

6.6  超声波清洗仪。

 

6.7  旋转蒸发仪。

 

6.8  KD浓缩瓶：25mL。

 

 

7、试样的制备与保存

 

7.1  试样的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织的可食部分，绞碎，并使均质。

 

    a)取均质后的供试样品，作为供试试样；

 

    b)取均质后的空白样品，作为空白试样；

 

7.2  试样的保存-18°C以下保存。

 

 

8、步骤

 

8.1  提取

 

    称取约5.0g(±0.01g)的试样于50mL离心管中。加入11mL乙腈，超声振荡提取2min，涡旋30s，4000r/min离心5min，将上清液收集到25mL比色管中。残渣再加乙腈11mL，重复提取一次，合并上清液。用乙腈定容至25mL，混匀备用。

 

8.2  净化

 

    移取5.0mL上述提取液至活化的中性氧化铝柱上，用KD浓缩瓶接收滤液。用4.0mL乙腈清洗中性氧化铝柱并收集所有滤液。45°C旋转蒸发至近干，用乙腈将残液定容1mL，超声震荡5min。加入1.0mL5mmol/L醋酸铵，超声震荡1min，经0.2μm滤膜过滤。

 

8.3  测定

 

8.3.1  表面增强拉曼光谱仪参考条件

 

    激光能量≥100mW。

 

    数据采集时间≥2s。

 

    激光波长785nm±1nm。

 

    响应范围300cm-1~1800cm-1，或大于该响应范围。

 

8.3.2  样品的测定

 

    将待测溶液、表面增强剂和无机盐混凝剂按5:1:1的比例加入样品池中，混合后进行拉曼检测。曝光时间为30s。

 

8.3.3  空白试样的测定

 

    称取5.0g空白试样，按照8.1和8.2步骤与样品同法操作，拉曼光谱仪检测。

 

8.3.4  加标试样的测定

 

    称取5.0g空白试样于离心管中，加入5mL孔雀石绿标准工作溶液（5.3.3），按照8.1和8.2步骤与样品同法操作，表面增强拉曼光谱仪检测。

 

8.4  结果的判定

 

    检测基于光谱435cm-1（±10cm-1）、1171cm-1（±10cm-1）、1615cm-1（±10cm-1）处的特征拉曼光谱，对样品中孔雀石绿的含量进行判定。若同时存在上述特征峰且信噪比大于3，则检测结果判定为阳性。阴性结果代表该样品中不含有孔雀石绿或浓度低于5.0μg/kg。每批样品应同时进行空白实验和加标样品对照质控实验，且空白试样测定结果应为阴性，加标试样测定结果应为阳性。

 

8.5  复检和确证

 

    本方法为初筛方法，若初检结果为阳性，需要按照8.1和8.2步骤重新检测；重复检测结果仍为阳性，需要采用参比方法确证。参比标准为GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》。当结果判定为阳性时，以参比标准方法确证结果为最终报告值。

 

 

9、方法的灵敏度和准确性验证

 

9.1  灵敏度该方法中孔雀石绿残留物的检出限为5.0μg/kg。

 

9.2  准确性验证在相同条件下进行至少三次连续的独立测定，结果为一致。

 

 

10、检测报告检

 

    测报告应包含以下数据:

 

   ——鉴定样品所需的所有信息；

 

    ——对本文件的引用；

 

    ——本文件中未指定或视为可选的任何操作细节，以及可能影响测试结果的任何事件的细节；

 

    ——测试日期；

 

    ——测试结果

 

附录A（资料性）

孔雀石绿拉曼光谱示例

 

A.1孔雀石绿的拉曼光谱

 

图A.1孔雀石绿（MG）和隐色孔雀石绿（LMG）的拉曼光谱

 

A.2含有不同浓度孔雀石绿的鱼肉样品的表面增强拉曼光谱

 

 

图A.2含有不同浓度孔雀石绿的鱼肉样品的表面增强拉曼光谱图（A：10μg/kg；B：5.0μg/kg；C：1.0μg/kg；D：空白）

 

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