动物性水产品及其制品中异尖线虫的检验-玺标标准物质中心

 

 

 

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1范围

本标准规定了动物性水产品及其制品中异尖线虫(Anisakidae)幼虫的形态学和PCR。

检验方法本标准适用于动物性水产品及其制品中异尖线虫幼虫的检验。

 

2 原理

动物性水产品及其制品中的异尖线虫幼虫主要寄生于海洋鱼类、甲壳类、软休类动物的肌肉和脏器表面等组织内。解剖分离或用胃蛋白酶消化动物性水产品及其制品的肌肉或脏器等组织获得虫体,根据幼虫的形态特征,判断异尖线虫科幼虫。对可疑虫体通过扩增异尖线虫核糖体 DNA 内转录间隔区(ITS)基因片段并测序,进行常见异尖线虫幼虫的鉴定。

 

 

 

 

3 仪器和设备

3.1 生物显微统:100X-400X。

3.2 体视显微镜:7.5X-150X。

3.3 PCR扩增仪。

3.4 凝胶成像系统。

3.5 电泳仪。

3.6 恒温培养箱:37℃±1℃。

3.7 高速离心机:转速≥12 000 r/min。

3.8 网筛:孔径 2 mm(10目)。

3.9 锥形量杯:1 000 ml。

3.10 微量移液器:0,2μl~2,5μl、lμl~10μl、l0μl~100μl、100μl~1 000μl。

 

4 试剂和材料

4.1 试剂

4.1.1 盐酸:36%一38% HCI 溶液。

4.1.2 生里盐水:0.85% NaCl 溶液。

4.1.3 1 mol/l Tris-HCl 溶液(pH 8.0)。

4.1.4 0.5 mol/I EDTA 溶溶液(pH 8.0)。

4.1.5 10% SDS 溶液。

4.1.6 5 mol/I NaCl 溶液。

4.1.7 3 000 U/mg 胃蛋白酶。

4.18 20 mg/ml.蛋门酶 K。

4.1.9 苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25 : 24 :1)。

4.1.10 5 U/μl 耐热 DNA 聚合酶。

4.1.11 10XPCR 缓冲液。

4.1.12 25 mmol/l. MgC2。

4,1.13 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP,每种浓度为 2.5 mmol/l。

4.1.14 琼脂糖:电泳级。

4.1.15 50XTAE 缓冲液:使用前用去离于水稀释成 1XTAE 缓冲液。

4.1.16 1XTE 溶液(pH 8.0)。

4.1.17 10 mg/ml.溴化乙锭(EB)或其他核酸染料。

4.1.18 6X上样缓冲液。

4.1.19 100 bp~2 000 bp DNA 分子标准。

4.1.20 PCR引物:浓度为 20 μmol/l。

正向引物 NC5:5'GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3'

反向引物 NC2:5'TTAGTTCTTTTCCTCCGCT-3'

扩增异尖线虫ITS 基因片段长度为 800 bp~100 bp。

 

4.2试剂配制

4.2.1 生理盐水:称取 8.5 g NaCl溶解于 900 ml去离子水，再加去离子水至 1 000 ml。

4.2.2 1 mol/l Tris-HIC溶液:取121.1g Tris(三羟甲基红氨甲烷)溶解于 800 ml.去离子水，用盐酸调 pH 至8.0,加去离子水至 1 000 ml.。

4.2.3 0.5 mol/l EDTA 溶液:称取 186,1 g Na2EDTA·2H2O(二水合乙二胺四乙酸二钠)溶解于800 ml去离子水,搅拌溶解,用 NaOH 调节pH 至 8.0,加去离子水至 1 000 ml。

4.2.4 5 mol/l NaCl 溶液:称取 292.5 g NaC溶解于 900 ml去离子水，再加水至 1 000 ml。

4.2.5 胃蛋白酶消化液;取胃蛋白酶 5 g,溶解于 900 ml.生理盐水中,加盐酸 7 ml,混匀,再加生理盐水至 1 000 ml，临川现配。

4.2.6 裂解液:10% SDS 溶液 100 ml、1 mol/l Tris-HCl 液 10 ml,0,5 mol/l.EDTA 溶液200 ml、5 mol/I.NaCl 溶液 20 ml,加灭菌去离子水至 1 000 ml。

4.2.7 1.5%琼脂糖凝胶;琼脂糖 15 g,加人 1XTAE 缓冲液至 100 ml,加热至完全融化后冷却至60℃~70℃,加人 10 mg/ml溴化乙锭5 μl，混匀，制备凝胶。

 

 

 

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