动物性水产品及其制品中华支睾吸虫的检验

1 范围

本标准规定了动物性水产品及其制品中华支睾坚吸虫(Cloorchis sinensis)囊蚴的形态学和 PCR 检验方法。

本标准适用于动物性水产品及其制品中华支睾坚吸虫囊蚴的检验。

 

2 原理

动物性水产品及其制品中的华支睾吸虫囊蚴主要寄生于淡水鱼和淡水虾的肌肉组织。用压片法观察囊蚴或使川胃蛋白酶消化动物性水产品及其制品的肌肉组织获得囊蚴。根据囊蚴的形态特征,初是判断囊蚴的种类。通过扩增华支睾吸虫核糖体 DNA 第二内转录向隔区(ITS2)基因片段并测序，进行华支睾吸虫囊蚴的鉴定。

 

 

 

 

 

3 仪器和设备

3.1 生物显微统:100X-400X。

3.2 体视显微镜:7.5X~150X。

3.3 PCR 扩增仪。

3.4 凝胶成像系统。

3.5 电泳仪。

3.6 恒温培养箱:37 ℃ ±1 ℃。

3.7 高速离心机:转速≥12 000 r/min。

3.8 网筛:孔径 0.25 mm(60 日)。

3.9 维形量杯:1 000 ml。

3.10 微量移液器:0.2 μl~2.5 μl、1μl~10μl、10μl~100μl、100μl-1000μl。

 

4 试剂和材料

4.1 试剂

4.1.1 盐酸:36%~38%HCI 溶液。

4.1.2 生里盐水:0.85%NaCl 溶液。

4.1.3 1 mol/l Tris-HCl 溶液(pH 8.0)。

4.1.4 0.5 mol/I EDTA 溶液(H 8.0)。

4.1.5 10% SDS 溶液。

4.1.6 5 mol/I NaCl 溶液。

4.1.7 3 000 U/mg 胃蛋内酶。

4.1.8 20 mg/ml 蛋白酶 K。

4.1.9 苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25 : 24 : 1)。

4.1.10 5 U/μl耐热 DNA 聚合酶。

4.1.11 10XPCR 缓冲液。

4,1.12 25 mmol/l MgCl2。

4,1.13 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP,每种浓度为 2.5 mmol/l。

4.1.14 琼脂糖:电泳级。

4,1.15 50XTAE 缓冲液:使用前用去离子水稀释成 1XTAE 缓冲液。

4.1.16 1XTE 溶液(pH 8.0)。

4.1.17 10 mg/ml.溴化乙锭(EB)或其他核酸染料。

4.1.18 6X上样缓冲液。

4,1.19 100 bp~2 000 bP DNA 分于量标准。

4.1.20 PCR引物:浓度为 20 μmol/l。

正向引物 CS1:5'-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3'

反向引物 CS2:5'-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3'

扩增华支睾吸虫ITS2 基因片段长应为 315 bp。

4.2 试剂配制

4.2.1 生里盐水;称取 8.5 g Nacl 溶解于 900 ml去离子水,再加去离子水至1 000 ml。

4.2.2 1 mol/l Tris-HCl 溶液:称取 121.1 g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解于 800 ml.去离子水,用盐酸调节 pH 至8.0,加去离子水至 1 000 ml。

4.2.3 0,5 mol/l EDTA 溶液:取 186.1 g Na2EDTA·2H2O(二水合乙二胺四乙酸二钠)溶解于800 ml去离子水,搅溶解,用 NaOH 调节pH 至 8.0,加去离子水至 1 000 ml。

4.2.4 5 mol/l NaCl溶液:取 292.5 g NaCl 溶于 900 ml.去离子水中,加去离子水至 1 000 ml。

4.2.5 胃蛋白酶消化液:取胃蛋白酶 5 g,溶解于 900 ml生理盐水中,加盐酸7 ml,混匀,再加生理盐水至 1 000 ml，临用现配。

4.2.6 裂解液:10% SDS 溶液 100 ml、l mol/l Tris-HCl溶液 10 ml、0.5 mol/l EDTA 溶液200 ml、5 mol/l NaCl 溶液 20 ml,加灭菌去离子水至 1 000 ml。

 

4,2.7 1.5%琼脂糖凝胶:琼脂糖 1.5 g,加人1XTAE 缓冲液至 100ml,加热至完全融化后冷却至60℃-70℃,加人 10 mg/ml溴化乙锭 5 μl,混匀，制备凝胶。

 

 

 

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